?molehill

molehill發(fā)音

英：[?m??lh?l]　　美：[?mo?lh?l]

英：　　美：

molehill中文意思翻譯

n. 鼴鼠丘

molehill詞形變化

名詞: molecularity | 副詞: molecularly |

molehill同義詞

molehill反義詞

molar

molehill常見(jiàn)例句

1 、Don't trust his words. He is a man who likes making a mountain out of molehill.───不要相信他的話(huà)，他是個(gè)愛(ài)夸大其詞的人。

2 、She's made a mountain out of a molehill.───她把一點(diǎn)小事夸得比天還大。

3 、A Dissertation Should "Make a Mountain out of a Molehill"───博士論文要"小題大做"

4 、It is nothing. Don't make a mountain out of a molehill.───小事情,不要小題大做。

5 、He always makes a mountain out of a molehill.───他老是大驚小怪。

6 、Make a mountain out of molehill.───小題大作。

7 、It isn't as serious as you made a mountain out of a molehill.───明明不像你說(shuō)的那么嚴重,你也太夸大其辭了！

8 、Guys, as they say, when one chapter ends, a bridge appears, and then you cross that bridge and make lemonade out of a molehill.─── 各位 就像他說(shuō)的 一章結束后 一座橋出現了 你走過(guò)那座橋 又是一番新天地

9 、Make a mountain out of a molehill: to exaggerate a minor problem.───小題大做:夸張一個(gè)小困難。

10 、make a mountain out of a molehill───v. 小題大作

11 、Never make a mountain of a molehill.───[諺]切勿小題大做。

12 、For the mistake the little kid made, the teacher made such a mountain out of a molehill as to hurt his self-respect.───對于那個(gè)小孩子所犯下的錯誤，老師是小題大做了，以至于傷害了他的自尊心。

13 、He meant to say "make a mountain out of a molehill," but he got it the wrong way round and said "make a molehill out of a mountain".───他想說(shuō)“小題大做”，說(shuō)擰了，說(shuō)成“大題小做”。

14 、Molehills can be mountains, acorns can be oaks.─── 山丘亦山峰 橡子乃橡樹(shù) 表象不是內在

15 、He only suffered a tiny cut. He made a real mountain out of a molehill.───他只是稍微割傷，但他卻弄得自己好像受了重傷一樣，小題大做。

16 、129.Don't make a mountain out of a molehill。───勿將鼴鼠丘看作大山；不要小題大做。

17 、Breaking out the yardstick to determine mountain from molehill can sometimes help clear your head.───有時(shí)候，拿尺子來(lái)區分大山、小丘可以幫你清晰頭腦。

18 、The giants of management education have laboured mightily to bring forth a molehill.───管理教育領(lǐng)域的巨人們竭盡全力搞出來(lái)的只是些毫無(wú)意義的東西。

19 、Stop making a mountain out of a molehill, I only made a little mistake.───不要再小題大作了，我只不過(guò)打碎了一個(gè)杯子。

20 、Killing a mosquito with a cannon/making a mountain out of molehill───高射炮打蚊子,小題大做

21 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi.───讓自由的回聲響徹密西西比州的每一座大山小丘吧!

22 、An old, close-bitten pasture, with a footpath wandering across it and a molehill here and there───這古老的牧場(chǎng)荒草參差，一條曲曲彎彎的小徑，一片鼴鼠拱起的土丘。

23 、She always makes a mountain out of a molehill.───停止小題大做，我只是打破了一個(gè)杯子。

24 、And I indulge you. I don't see a molehill.─── 我還縱容你 我沒(méi)有小題大做

25 、You are not hurt badly. Stop trying to make a mountain out of a molehill with crying.───你的傷并不重，不要小題大做，這么放聲大哭。

26 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring.───讓自由響自密西西比的每一座山和每一個(gè)鼴鼠丘。

27 、A man through great timidity or sloth often turns a molehill into a mountain.───一個(gè)人出極端害怕或懶惰往往會(huì )小題大做。

28 、She was only five minutes late, but he made a mountain out of a molehill about it.───她只不過(guò)遲到了五分鐘, 但他卻因此而大做文章。

29 、make a mount of a molehill───小題大做

30 、Let freedom ring from every hill and molehill of Huangtu Tableland, from every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從黃土高原的每一道山丘響起吧！在每一道山坡上，讓自由之聲響起吧！

31 、Stop trying to make a mountain out of molehill.───不要小題大作。

32 、First, the president hardly represents any moral high ground, and his absence would not move a molehill let alone a mountain.───首先，總統并不能代表任何道德高位，而他的缺席也并不會(huì )移動(dòng)一個(gè)小小的鼴鼠丘，更不要說(shuō)是一座大山了。

33 、Molehills are simply mounds of earth serving as condominiums for *all mammals.─── 鼴鼠丘只是小土堆 相當于小哺乳動(dòng)物的公寓

34 、Why do you always have to make a mountain out of a molehill?───你為什么總是小題大做?

35 、It was an old, rabbit-bitten pasture, with a foot-track wandering across it and a molehill here and there───這是片古老的牧場(chǎng)，給兔子啃得七零八落，一條踏出的小徑橫穿其中，這里那里盡是鼴鼠拱出的小丘。

36 、Do not make a mountain out of a molehill.───不要小題大做。

37 、I'm sure she'll give you the money back, so there's no need to start making a mountain out of a molehill.───我相信她會(huì )把錢(qián)還你的,所以沒(méi)有必要小題大作。

38 、Let freedom ring from every hill and every molehill of Mississippi.From every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從科羅拉多白雪皚皚的洛磯山上響起！

39 、What I'm going to do is, uproot the palm tree, create a 3foot high molehill, and then replant it on top of it.─── 我要做的是 堆一個(gè) 三英尺高的山坡 把棕櫚樹(shù)種上去

40 、You're not hurt badly. Stop trying to make a mountain out of a molehill with crying.───你傷得并不重，不要大驚小怪地嚷嚷，小題大做了。

41 、...he was making a molehill out of a mountain.─── 他更像是把大山說(shuō)成了鼴鼠丘

42 、My mountain is higher than your molehill.───我的山要比你的丘陵高。

43 、We shouldn't believe that media's words for it; they often make a mountain out of a molehill after all.───這家媒體的言論不太能夠采信，畢竟他們常常作出小題大作的報導。

44 、6、You're making a mountain out of a molehill if you think that one twinge of toothache means that you must have several teeth extracted.───如果你認為一次牙痛就意味著(zhù)要撥去數顆牙的話(huà)，那你把問(wèn)題看得太嚴重了。

45 、Let freedom ring from eery hill and eery molehill of Mississippi.───讓自由之聲響徹密西西比州的一座座山峰，一個(gè)個(gè)土丘！

46 、Despite my sister's years of therapy, she still has a tendency to make mountains out of molehills.─── 盡管我老妹看了多年心理醫生 她還是習慣性小題大做

47 、To make a mountain out of a molehill.───小題大做。

48 、Let freedom ring from every hill and every molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring.───這是我祖先終老的地方，這是早期移民自豪的地方，讓自由之聲，響徹每一座山崗。

49 、The situation is not as serious as the newspapers make it out to be. They're just trying to make a mountain out of a molehill.───情況并不像報紙上所說(shuō)的那么嚴重。這些文章夸大其詞了。

50 、And the ultimate stumbling-block, though a mountain to India, was surely a molehill to a country of America's wealth.───這最終的障礙對于印度人來(lái)說(shuō)是個(gè)大難題，可是對于美國人來(lái)說(shuō)就是小菜一碟了。

51 、You're making a mountain out of a molehill.───你在小題大做。

52 、I am sure she'll give you the money back,so there's no need to start make a mountain out of a molehill.───我相信她會(huì )把錢(qián)還你的，所以沒(méi)有必要小題大做。

53 、It is only a simple job, but he makes a mountain out of a molehill.───這只是很簡(jiǎn)單的工作，但是他卻大費周章，搞了很多事出來(lái)。

54 、"I'm sure she'll give you the money back, so there's no need to start making a mountain out of a molehill."───"我相信她會(huì )把錢(qián)還你的,所以沒(méi)有必要小題大做。"

55 、Let freedom ring from eextremeccly hill and molehill of Mississippi, from eextremeccly mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從密西西比州的每一道山丘響起吧！在每一道山坡上，讓自由之聲響起吧！

56 、If you ask your friends what they think, they will tell you that you are making a mountain out of a molehill and that you need to relax and gain perspective.───如果你詢(xún)問(wèn)你的朋友的想法，，他們會(huì )告訴你，你太小題大做了，你需要放松下來(lái)去反思一下。

57 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi, from every mountainside, let freedom ring.───讓自由之聲從密西西比州的每一道山丘響起吧!在每一道山坡上,讓自由之聲響起吧!

58 、Your “broken arm” was only a sprained wrist. Dont make amountainout of a molehill.───你只是扭了一下手腕，哪有摔斷胳膊。別小題大做了。（實(shí)習編輯：顧萍）

59 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi. From every mountainside, let freedom ring!───讓自由之聲響徹密西西比州的一座座山峰，一個(gè)個(gè)土丘。讓自由之聲響徹每一個(gè)山岡！

60 、Let outlook ring from every hill and every molehill of Sacred Temple.───讓光明之聲響徹圣廟，響徹云省的一座座山峰，一個(gè)個(gè)土丘!

61 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi and every mountainside.───讓自由之聲從密西西比的每一座丘陵和山坡響起來(lái)！

62 、Let freedom ring from every hill and molehill of Mississippi, from every mountainside.───讓自由之聲響徹密西西比的每個(gè)丘陵，每座角落！

63 、The expression "making a mountain out of a molehill" simply means making a big deal out of a *all deal.─── "把鼴鼠丘說(shuō)成大山"這句話(huà) 意思是把小事鬧得很大

64 、Make a mountain out of a molehill; make something serious out of something trivial───虛張聲勢;夸大其辭;小題大作

65 、Make a mountain out of a molehill Calm down. There's really nothing to worry about. You're making a mountain out of a molehill.───冷靜!根本沒(méi)必要擔心。你真是大題小作。

66 、eg: Your “broken arm ”was only a sprained wrist. Don't make a mountain out of a molehill.───你只是扭了一下手腕，哪有摔斷胳膊。別小題大做了。

分子鑒定技術(shù)發(fā)展歷程？

沃森和克里克提出DNA雙螺旋結構，“生命之謎”被打開(kāi)，經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)、DNA測序技術(shù)之后分子診斷正在快速成為人類(lèi)疾病診斷的最有效方式之一。

發(fā)展四階段

第一階段：利用分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病基因診斷：通過(guò)嬰兒胚胎期進(jìn)行產(chǎn)前診斷，超早期預知某些疾病發(fā)生、發(fā)展和預后。1978年著(zhù)名沒(méi)計劃以科學(xué)家簡(jiǎn)悅威等應用液相DNA分子雜交成功進(jìn)行了鐮形細胞貧血癥的基因診斷。

第二階段：以PCR為基礎的分子診斷：PMullis發(fā)明PCR技術(shù)后迅速發(fā)展，標志著(zhù)傳統基因診斷發(fā)展到更全面的分子診斷技術(shù)。

第三階段：以生物芯片技術(shù)為代表的高通量檢測技術(shù)：1992年美國Affymetrix制作出第一章基因芯片，標志著(zhù)分子診斷進(jìn)入生物芯片技術(shù)階段。生物芯片技術(shù)解決了傳統核酸印跡雜交技術(shù)復雜、自動(dòng)化程度低、檢測目的分子數量少、低通量的問(wèn)題。

第四階段：以NIPT為代表的第二代測序技術(shù)：Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相與液相載體中通過(guò)邊合成邊測序的方法-焦**酸測序。目前常見(jiàn)的高通量第二代測序平臺主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均為通過(guò)DNA片段化構建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進(jìn)行擴增、在載體面上進(jìn)行邊合成邊測序反應，使得第1代測序中最高基于96孔板的平行通量擴大至載體上百萬(wàn)級的平行反應，完成對海量數據的高通量檢測。

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分子鑒定技術(shù)發(fā)展歷程？

分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常，以確定受檢者有無(wú)基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。通俗簡(jiǎn)單的講所有基于分子生物學(xué)水平的方法學(xué)技術(shù)都屬于分子診斷技術(shù)，比如PCR技術(shù)、基因測序技術(shù)等等。

PCR技術(shù)即聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程，由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成：模板DNA的變性，模板DNA與引物的退火(復性)，引物的延伸。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡(jiǎn)易DNA擴增法，意味著(zhù)PCR技術(shù)的真正誕生。簡(jiǎn)單講PCR技術(shù)本質(zhì)上是針對DNA片段進(jìn)行擴增放大，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)使得樣本中DNA含量可以檢測出來(lái)。

基因測序技術(shù)即測定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A，T，C，G四組不同長(cháng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應用。簡(jiǎn)單講基因測序技術(shù)是針對DNA片段進(jìn)行測序和分析，使得DNA序列得以清晰。

下面一起來(lái)了解一下分子診斷技術(shù)近50年的發(fā)展歷程：

一、基于分子雜交的分子診斷技術(shù)

上世紀60年代至80年代是分子雜交技術(shù)發(fā)展最為迅猛的20年,由于當時(shí)尚無(wú)法對樣本中靶基因進(jìn)行人為擴增,人們只能通過(guò)已知基因序列的探針對靶序列進(jìn)行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎理論、探針固定包被技術(shù)與cDNA探針人工合成的出現,為基于分子雜交的體外診斷方法進(jìn)行了最初的技術(shù)儲備。

(一)DNA印跡技術(shù)(Southern blot)

Southern[1]于1975年發(fā)明了DNA印跡技術(shù),通過(guò)限制性?xún)惹忻笇NA片段化,再以凝膠電泳將長(cháng)度不等的DNA片段進(jìn)行分離,通過(guò)虹吸或電壓轉印至醋酸纖維膜上,再使膜上的DNA變性與核素標記的寡核苷酸探針進(jìn)行分子雜交,經(jīng)洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時(shí)具備DNA片段酶切與分子探針雜交,保證了檢測的特異性。因此,一經(jīng)推出后便成為探針雜交領(lǐng)域最為經(jīng)典的分子檢測方法,廣為運用于各種基因突變,如缺失、**入、易位等,及與限制性酶切片段長(cháng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鑒定中。Alwine等[2]于1977年推出基于轉印雜交的Northern blot技術(shù)也同樣成為當時(shí)檢測RNA的金標準。

(二)ASO反向斑點(diǎn)雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印跡技術(shù)進(jìn)行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性,但存在操作極為繁瑣,檢測時(shí)間長(cháng)的缺點(diǎn)。1980年建立的樣本斑點(diǎn)點(diǎn)樣固定技術(shù)則擺脫了傳統DNA印跡需要通過(guò)凝膠分離技術(shù)進(jìn)行樣本固定的缺點(diǎn)。通過(guò)在質(zhì)粒載體導入單堿基突變的方法,構建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使對核酸序列點(diǎn)突變的檢測成為可能。1986年,Saiki[3]首次將PCR的高靈敏度與ASO斑點(diǎn)雜交的高特異性結合起來(lái),實(shí)現了利用ASO探針對特定基因多態(tài)性進(jìn)行分型。其后為了完成對同一樣本的多個(gè)分子標記進(jìn)行高通量檢測,Saiki[4]又發(fā)明了ASO-RDB,通過(guò)將生物素標記的特異性PCR擴增產(chǎn)物與固定于膜上的探針雜交顯色,進(jìn)行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上,只需通過(guò)1次雜交反應,即可篩查待檢樣本DNA的數十乃至數百種等位基因,具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn),一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術(shù)。

(三)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素標記的原位雜交技術(shù),1977年Rudkin[5]首次使用熒光素標記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀8090年代,細胞遺傳學(xué)和非同位素標記技術(shù)的發(fā)展將FISH推向臨床診斷的實(shí)踐應用。相比于其它僅針對核酸序列進(jìn)行檢測的分子診斷技術(shù),FISH結合了探針的高度特異性與組織學(xué)**的優(yōu)勢,可檢測**完整細胞或經(jīng)分離的染色體**定的正?；虍惓NA序列;由于使用高能量熒光素標記的DNA探針,可實(shí)現多種熒光素標記同時(shí)檢測數個(gè)靶點(diǎn)。

如今,FISH已在染色體核型分析,基因擴增、 基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應用。通過(guò)比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)與光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技術(shù),使其正在越來(lái)越多的臨床診斷領(lǐng)域中發(fā)揮作用。

(四)多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技術(shù)于2002年由Schouten等[6]首先報道。每個(gè)MLPA探針包括2個(gè)熒光標記的寡核苷酸片段,1個(gè)由化學(xué)合成,1個(gè)由M13噬菌體衍生法制備;每個(gè)探針都包括1段引物序列和1段特異性序列。在MLPA反應中,2個(gè)寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交,再使用連接酶連接2部分探針。連接反應高度特異,只有當2個(gè)探針與靶序列完全雜交,連接酶才能將2段探針連接成1條完整的核酸單鏈;反之,如果靶序列與探針序列不完全互補,即使只有1個(gè)堿基的差別,就會(huì )導至雜交不完全,使連接反應無(wú)法進(jìn)行。連接反應完成后,用1對熒光標記的通用引物擴增連接好的探針,每個(gè)探針擴增產(chǎn)物的長(cháng)度都是唯一的。最后,通過(guò)毛細管電泳分離擴增產(chǎn)物,便可對把核酸序列進(jìn)行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理,MLPA技術(shù)最多可在1次反應中對45個(gè)靶序列的拷貝數進(jìn)行鑒定。

該技術(shù)具備探針連接反應的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經(jīng)過(guò)MRC-Holland公司10余年的發(fā)展,MLPA技術(shù)已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因學(xué)多遺傳位點(diǎn)鑒定、腫瘤相關(guān)基因突變譜篩查、DNA甲基化程度定量等綜合分子診斷體系,是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數變異進(jìn)行檢測的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研發(fā)的光蝕刻技術(shù)制備了首個(gè)以玻片為載體的微陣列,標志著(zhù)生物芯片正式成為可實(shí)際應用的分子生物學(xué)技術(shù)。時(shí)至今日,芯片技術(shù)已經(jīng)得到了長(cháng)足的發(fā)展,如果按結構對其進(jìn)行分類(lèi),基本可分為基于微陣列(microarray)的雜交芯片與基于微流控(microfluidic)的反應芯片2種。

1.微陣列芯片

(1)固相芯片:微陣列基因組DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:將微陣列技術(shù)應用于MGDP檢測中已有超過(guò)十年的歷史,其技術(shù)平臺主要分為2類(lèi),即微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型雜交陣列(SNP array)。顧名思義,aCGH芯片使用待測DNA與參比DNA的雙色比對來(lái)顯示兩者間的拷貝數變異(CNV)的變化,而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片則無(wú)需與參比DNA進(jìn)行比較,直接通過(guò)雜交信號強度顯示待測DNA中的SNP信息。隨著(zhù)技術(shù)的不斷進(jìn)步,目前市場(chǎng)上已出現可同時(shí)檢測SNP與CNV的高分辨率混合基因陣列芯片。MGDP芯片主要應用于發(fā)育遲緩、先天性異?；蔚葍和z傳病的輔助診斷及產(chǎn)前篩查。經(jīng)驗證,使用MGDP芯片進(jìn)行染色體不平衡檢測與FISH的診斷符合率可達100%[8],表達譜芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片繪制了mRNA表達譜信息。隨著(zhù)表觀(guān)遺傳學(xué)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到重視,目前也已出現microRNA芯片、長(cháng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。類(lèi)似于MGDP芯片,GEP芯片使用反轉錄后生成的cDNA文庫與固定于芯片載體上的核酸探針進(jìn)行雜交,從而檢測雜交熒光信號的強度判斷基因的表達情況。相較于基因組雜交,GEP芯片對生物學(xué)意義更為重要的轉錄組信息進(jìn)行檢測,對疾病的診斷與預后判斷具有特殊的意義。目前使用GEP芯片對急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病及神經(jīng)退行性變等進(jìn)行診斷、分類(lèi)及預后評估已經(jīng)獲得了令人滿(mǎn)意的效果;

(2)液相芯片:傳統固相芯片將檢測探針錨定于固相載體上捕獲目的序列,而Luminex公司的xMAP技術(shù)[10]則通過(guò)搭配不同比例的2種紅色熒光染料,將聚苯乙烯微球標記為不同的熒光色,并對其進(jìn)行編碼得到具有上百種熒光編號的微球。通過(guò)xTAG技術(shù)將不同的特異性雜交探針交聯(lián)至編碼微球上,使得不同的探針能夠通過(guò)微球編碼得以區分。利用混合后的探針-微球復合物與待測樣本進(jìn)行雜交,使微球在流動(dòng)鞘液的帶動(dòng)下通過(guò)紅綠雙色流式細胞儀,其中紅色激光檢測微球編碼,綠色熒光檢測經(jīng)雜交后核酸探針上熒光報告基團的信號強度,一次完成對單個(gè)樣本中多種靶序列的同時(shí)鑒定。目前,該技術(shù)已在囊性纖維化等遺傳性疾病診斷、多種呼吸道病毒鑒定及人乳頭瘤病毒分型取得了廣泛的應用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了將毛細管電泳與進(jìn)樣設備整合到固相玻璃載體上構建“微全分析系統”的構想,通過(guò)分析設備的微型化與集成化,完成傳統分析實(shí)驗室向芯片上實(shí)驗室(lab-on-chip)的轉變。微流控芯片(microfluidic chip)由微米級流體的管道、反應器等元件構成,與宏觀(guān)尺寸的分析裝置相比,其結構極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和**效應在內的特殊性能,從而在1張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預處理、分子生物學(xué)反應、檢測等系列實(shí)驗過(guò)程。

目前使用微流控芯片進(jìn)行指導用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測是主要臨床應用領(lǐng)域。

二、核酸序列測定

測序反應是直接獲得核酸序列信息的唯一技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長(cháng)足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術(shù)上的金標準。

(一)第1代測序

1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進(jìn)行DNA序列測定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學(xué)修飾降解法的模型,為核酸測序時(shí)代的來(lái)臨拉開(kāi)了序幕。

Sanger等于同年提出的末端終止法(Sanger測序法)利用2'與3'不含羥基的雙脫氧核苷三**酸(ddNTP)進(jìn)行測序引物延伸反應,ddNTP在DNA合成反應中不能形成**酸二酯鍵,DNA合成反應便會(huì )終止。如果分別在4個(gè)獨立的DNA合成反應體系中加入經(jīng)核素標記的特定ddNTP,則可在合成反應后對產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自顯影,根據電泳條帶確定待測分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基礎上,于1986年推出了首臺商業(yè)化DNA測序儀PRISM 370A,并以熒光信號接收和計算機信號分析代替了核素標記和放射自顯影檢測體系。該公司于1995年推出的首臺毛細管電泳測序儀PRISM 310更是使測序的通量大大提高。Sanger測序是最為經(jīng)典的一代測序技術(shù),仍是目前獲取核酸序列最為常用的方法。

(二)第2代測序

1.焦**酸測序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger測序法所使用的合成后測序理念,Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相[13]與液相[14]載體中通過(guò)邊合成邊測序的方法-焦**酸測序。其基本原理是利用引物鏈延伸時(shí)所釋放的焦**酸基團激發(fā)熒光,通過(guò)峰值高低判斷與其相匹配的堿基數量。由于使用了實(shí)時(shí)熒光監測的概念,焦**酸測序實(shí)現了對特**點(diǎn)堿基負荷比例的定量,因此在SNP位點(diǎn)檢測、等位基因(突變)頻率測定、細菌和病毒分型檢測方面應用廣泛。由于熒光報告原理不同,其對于序列變異的檢測靈敏度從Sanger測序的20%提高到了5%。但由于該技術(shù)的儀器采購與單次檢測成本較高,目前尚未得到大規模的臨床使用。

2.高通量第2代測序

目前常見(jiàn)的高通量第二代測序平臺主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均為通過(guò)DNA片段化構建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進(jìn)行擴增、在載體面上進(jìn)行邊合成邊測序反應,使得第1代測序中最高基于96孔板的平行通量擴大至載體上百萬(wàn)級的平行反應,完成對海量數據的高通量檢測。該技術(shù)可以對基因組、轉錄組等進(jìn)行真正的組學(xué)檢測,在指導疾病分子靶向治療、繪制藥物基因組圖譜指導個(gè)體化用藥、感染性疾病的病原微生物宏基因組鑒定及通過(guò)母體中胎兒DNA信息進(jìn)行產(chǎn)前診斷等方面已經(jīng)取得了喜人的成績(jì)。然而,由于該技術(shù)需要對DNA進(jìn)行片段化處理,測序反應讀長(cháng)較短(如Solexa與SOLiD系統單次讀長(cháng)僅50bp),需要對數據進(jìn)行大規模拼接,因此對分子診斷工作者掌握生物信息學(xué)知識提出了更高要求,以利于后期的測序數據分析。

(三)第3代測序

第3代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序。該技術(shù)的操作平臺目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔技術(shù)等。該技術(shù)進(jìn)一步降低了成本,可對混雜的基因物質(zhì)進(jìn)行單分子檢測,故對SNP、CNV的鑒定更具功效。但是目前其進(jìn)入產(chǎn)品商業(yè)化,并最終投入臨床應用仍有很長(cháng)的距離。

三、基于分子構象的分子診斷技術(shù)

(一)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)與單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年間,Fischer等[15]與Orita等[16]分別提出了利用核酸序列變異所導至雙鏈變性條件差異與單鏈空間折疊差異,通過(guò)變性與非變性PAGE對變異序列進(jìn)行分離鑒定的方法,即DGGE與SSCP。上述2項技術(shù)均通過(guò)變異核酸分子在空間構象上的差異,通過(guò)特定條件下電泳速率的變化進(jìn)行檢測。正因為核酸分子構象具有序列特異性,且對于序列的改變非常敏感,常常1個(gè)堿基的變化也能得到鑒定。但由于DGGE與SSCP均必須進(jìn)行PCR后開(kāi)蓋電泳的操作,現已不常見(jiàn)于臨床檢測。

(二)變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用異源雙鏈變性分離變異序列、使用色譜洗脫鑒定的技術(shù),稱(chēng)為dHPLC,可自動(dòng)檢測單堿基置換及小片段核苷酸的**入或缺失。對于存在一定比例變異序列的核酸雙鏈混合物,其經(jīng)過(guò)變性和復性過(guò)程后,體系內將出現2種雙鏈:一種為同源雙鏈,由野生正義鏈-野生反義鏈或變異正義鏈-變異反義鏈構成的核酸雙鏈;另一種為異源雙鏈,即雙鏈中1條單鏈為野生型,而另1條為變異型。由于存在部分堿基錯配的異源雙鏈 DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同,在相同的部分變性條件下,異源雙鏈因存在錯配區而更易變性,被色譜柱保留的時(shí)間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來(lái),從而在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線(xiàn)。由于該技術(shù)使用了較高分析靈敏度的色譜技術(shù)進(jìn)行檢測,可快速檢出<5%負荷的變異序列。但需注意的是,由于該技術(shù)主要通過(guò)異源雙鏈進(jìn)行序列變異檢測,其不能明顯區分野生型與變異型的純合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用過(guò)飽和熒光染料將PCR產(chǎn)物全長(cháng)進(jìn)行熒光被動(dòng)標記,再通過(guò)簡(jiǎn)單的產(chǎn)物熔解分析對單個(gè)堿基變化進(jìn)行鑒定。該技術(shù)的原理也是通過(guò)異源雙鏈進(jìn)行序列變異鑒定。待測樣本經(jīng)PCR擴增后,若存在序列變異雜合子,則形成異源雙鏈,其熔解溫度大大下降。此時(shí)由于雙鏈被飽和染料完全填充,其產(chǎn)物熔解溫度的變化便可通過(guò)熔解曲線(xiàn)的差異得以判定。對于變異純合子而言,HRMA也可利用其較高的分辨率完成PCR產(chǎn)物單個(gè)位點(diǎn)A:T雙鍵配對與G:C三建配對熱穩定性差異的鑒定,但是對于Ⅱ、Ⅲ類(lèi)SNP的純合子變異則無(wú)法有效區分。

如何利用DNA構象對序列進(jìn)行推測,從而避免成本較高的序列測定或操作繁瑣的雜交反應一直是分子生物學(xué)研究與應用的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前,使用構象變化對序列變異進(jìn)行間接檢測的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成對變異序列單次閉管的擴增檢測反應。但需要注意的是,由于基于構象變化的分子檢測手段多無(wú)法通過(guò)探針雜交或核酸序列測定對檢測的特異性進(jìn)行嚴格的保證,因此其只適合大規模的初篩,而真正的確診仍需要進(jìn)行雜交或測序的驗證。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子診斷檢測技術(shù),qPCR具有2項優(yōu)勢,即核酸擴增和檢測在同一個(gè)封閉體系中通過(guò)熒光信號進(jìn)行,杜絕了PCR后開(kāi)蓋處理所帶來(lái)擴增產(chǎn)物的污染;同時(shí)通過(guò)動(dòng)態(tài)監測熒光信號,可對低拷貝模板進(jìn)行定量。正是由于上述技術(shù)優(yōu)勢,qPCR已經(jīng)成為目前臨床基因擴增實(shí)驗室接受程度最高的技術(shù),在各類(lèi)病毒、細菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達水平監控等多種臨床實(shí)踐中得到大量應用。但伴隨著(zhù)qPCR技術(shù)的迅猛發(fā)展,有關(guān)這項技術(shù)的質(zhì)量管理問(wèn)題也日益突出,如何消除各類(lèi)生物學(xué)變量所引起的檢測變異,減少或抑制實(shí)驗操作與方法學(xué)中的各種干擾因素是qPCR技術(shù)面臨的難題。

(一)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)

1.雙鏈摻入法

1992年Higuchi等[20-21]通過(guò)在PCR反應液中摻入溴乙錠對每個(gè)核酸擴增熱循環(huán)后的熒光強度進(jìn)行測定,提出了使用熒光強度與熱循環(huán)數所繪制的核酸擴增曲線(xiàn),定量反應體系中初始模板的反應動(dòng)力學(xué)(real-time PCR)模型,開(kāi)創(chuàng )了通過(guò)實(shí)時(shí)閉管檢測熒光信號進(jìn)行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA雙鏈,且只有嵌入雙鏈時(shí)才釋放熒光,在每1次的擴增循環(huán)后檢測反應管的熒光強度,繪制熒光強度-熱循環(huán)數的S形核酸擴增曲線(xiàn),以熒光閾值與擴增曲線(xiàn)的交點(diǎn)在擴增循環(huán)數軸上的投影作為循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct),則Ct與反應體系中所含初始模板數量呈負指數關(guān)系,推斷初始模板量。隨后Morrison[22]提出了使用高靈敏度的雙鏈染料SYBR Green I進(jìn)行反應體系中低拷貝模板定量的方法。這一方法操作簡(jiǎn)便,但由于僅使用擴增引物的序列啟動(dòng)核酸擴增,其產(chǎn)物特異性無(wú)法得到充分保證。雖然在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應后可通過(guò)熔解曲線(xiàn)對產(chǎn)物特異性進(jìn)行檢驗,但其特異性明顯遜于使用熒光探針進(jìn)行檢測,因此雙鏈摻入法并未在臨床實(shí)踐中得到認可。

2.Taqman探針

由于雙鏈摻入法存在特異性較低的問(wèn)題,1996年Heid[23]綜合之前發(fā)現的Taq酶的5'核酸酶活性與熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探針的概念提出了使用Taqman探針進(jìn)行qPCR的方法。TaqMan探針的本質(zhì)是FRET寡核苷酸探針,在探針的5'端標記熒光報告基團,3'端標記熒光淬滅基團,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR過(guò)程中水解與靶序列結合的寡核苷酸探針,使熒光基團得以游離,釋放熒光信號。從而使能夠與靶序列雜交的探針在擴增過(guò)程中釋放熒光,通過(guò)real-time PCR的原理對其進(jìn)行定量。由于其超高的特異性與成功的商品化**,Taqman探針已經(jīng)成為目前臨床使用最為廣泛的qPCR方法,其在各種病毒基因定量檢測、基因分型、腫瘤相關(guān)基因表達檢測等方面具有著(zhù)不可替代的地位。

3.分子信標

同樣在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信標(moleuclar beacons)進(jìn)行qPCR的方法,分子信標是5'與3'端分別標記有熒光報告基團與淬滅基團的寡核苷酸探針,其兩端具有互補的高GC序列,在qPCR反應液中呈發(fā)夾結構,熒光基團與淬滅基團發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)而保持靜息狀態(tài)。當PCR反應開(kāi)始后,莖環(huán)結構在變性高溫條件下打開(kāi),釋放熒光;在退火過(guò)程中,靶序列特異性探針則與模板雜交保持線(xiàn)性,不能與模板雜交的探針則復性為莖環(huán)結構而熒光淬滅,通過(guò)檢測qPCR體系中退火時(shí)的熒光信號強度,便可以real-time PCR原理特異性檢測體系中的初始模板濃度。相比于Taqman探針,分子信標使用發(fā)卡結構使熒光基團與淬滅基團在空間上緊密結合,大大降低了檢測的熒光背景,其檢測特異性較Taqman探針更高,更適合等位基因的分型檢測。

4.雙雜交探針

1997年,Wittwer等[25]發(fā)表了使用分別標記熒光供體基團與熒光受體基團的2條相鄰寡核苷酸探針進(jìn)行qPCR的方法。雙雜交探針所標記的供體基團和受體基團的激發(fā)光譜間具有一定重疊,且2條探針與靶核酸的雜交位置應相互鄰近。僅當2條探針與靶基因同時(shí)雜交時(shí),供體與受體基因得以接近,從而通過(guò)FRET發(fā)生能量傳遞,激發(fā)熒光信號,熒光信號強度與反應體系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2條探針進(jìn)行靶序列雜交,該方法的特異性比傳統單探針檢測體系得到了極大地提升。

(二)數字PCR

早在上世紀90年代就出現了使用微流控陣列對單次qPCR反應進(jìn)行分散檢測的概念?；谶@一理念,Vgelstein與Kinzter[26]于1999年發(fā)表了數字PCR(digital PCR)的方法,對結腸癌患者糞便中的微量 K-RAS基因突變進(jìn)行了定量。相比于傳統的qPCR方法,數字PCR的核心是將qPCR反應進(jìn)行微球乳糜液化,再將乳糜液分散至芯片的微反應孔中,保證每個(gè)反應孔中僅存在≤1個(gè)核酸模板。經(jīng)過(guò)PCR后,對每個(gè)微反應孔的熒光信號進(jìn)行檢測,存在靶核酸模板的反應孔會(huì )釋放熒光信號,沒(méi)有靶模板的反應孔就沒(méi)有熒光信號,以此推算出原始溶液中待測核酸的濃度。因此,數字PCR是1種檢測反應終點(diǎn)熒光信號進(jìn)行絕對定量的qPCR反應,而非以模板Ct值進(jìn)行核酸定量的real-time PCR。

經(jīng)由Quantalife公司開(kāi)發(fā)(已于2011年被BIO-RAD收購)的微滴式數字PCR是首款商品化的數字PCR檢測系統,目前已被廣泛運用于微量病原微生物基因檢測、低負荷遺傳序列鑒定、基因拷貝數變異與單細胞基因表達檢測等多個(gè)臨床前沿領(lǐng)域。與傳統qPCR相比較,該技術(shù)具有超高的靈敏度與精密度,使其成為目前qPCR領(lǐng)域的新星。

五、對未來(lái)5年的展望

半個(gè)世紀以來(lái)分子診斷的高速發(fā)展離不開(kāi)分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。概而言之,在過(guò)去的50年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉化與3項提升:即報告信號檢測從放射核素標記向熒光標記轉化,操作方法由手工操作向全自動(dòng)化轉化,檢測分析通量從單一標志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉化;檢測靈敏度、精密度、特異性的快速提升。

在未來(lái)5年中,我國分子診斷事業(yè)將迎來(lái)兩方面的進(jìn)步。隨著(zhù)衛生監管部門(mén)對分子診斷重要性的認識不斷深入與越來(lái)越多高學(xué)歷、高素質(zhì)人才的進(jìn)入,分子診斷將會(huì )出現理念的革命性進(jìn)步,高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實(shí)際應用中。隨著(zhù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,傳統針對特定基因異常、病原微生物感染鑒定的方法學(xué),也將在檢測的各項分析性能與操作便捷程度上取得長(cháng)足的進(jìn)步。對于傳統人力與時(shí)間成本較高的檢測方法學(xué),將出現兩極分化的態(tài)勢,即Southern等經(jīng)典的檢測金標準將得到保留;而ASO-RDB等靈敏度、特異性均不能滿(mǎn)足實(shí)際臨床需求的方法將快速被新型技術(shù)所取代。最終,分子診斷也必將一改目前僅僅用于病原微生物基因檢測與部分遺傳性疾病診斷的局面,形成由腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、藥物基因組學(xué)四足鼎立,快速發(fā)展的景象。

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