atgc縮寫(xiě)是什么意思

ATGC英文含義

1、ATGC的英文全稱(chēng)：Adenine,Thymine, Guanine, & Cytosine | 中文意思：───腺嘌呤、胞核嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶

2、ATGC的英文全稱(chēng)：Asiantaeth Trwyddedu Hywyr A Cherbydau (Welsh: Driver and Vehicle Licensing Agency, UK) | 中文意思：───Asiantaeth Trwyddedu Hywyr A Cherbydau（威爾士語(yǔ)：英國駕駛員和車(chē)輛牌照局）

3、ATGC的英文全稱(chēng)：Asian Textiles and Garments Council | 中文意思：───亞洲紡織品和服裝局

4、ATGC的英文全稱(chēng)：A T G, Inc. | 中文意思：───A T G公司。

5、ATGC的英文全稱(chēng)：Another Tool for Genome Comparison | 中文意思：───基因組比較另一個(gè)工具

6、ATGC的英文全稱(chēng)：Association of Therapeutic Goods Consultants | 中文意思：───治療產(chǎn)品顧問(wèn)協(xié)會(huì )

pcr試驗是什么意思

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現 ，而較具有實(shí)驗價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應?，F今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng) Taq polymerase), 則是于1976年從 溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的 酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類(lèi)似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應）的實(shí)驗。而現今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著(zhù)特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。

DNA的半保留復制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗中發(fā)現，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì )失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展。

發(fā)現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應用，并逐步應用于臨床。

PCR技術(shù)的基本原理 類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。

pcr試驗是什么意思

PCR目錄

〔PCR原理〕

PCR反應體系與反應條件

〔PCR步驟〕

〔PCR檢測〕

〔PCR反應特點(diǎn)〕

[PCR儀器]

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現 ，而較具有實(shí)驗價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應?，F今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng) Taq polymerase), 則是于1976年從 溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的 酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類(lèi)似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應）的實(shí)驗。而現今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著(zhù)特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。

[編輯本段]〔PCR原理〕

DNA的半保留復制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗中發(fā)現，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì )失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展。

發(fā)現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應用，并逐步應用于臨床。

PCR技術(shù)的基本原理 類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。

[編輯本段]PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul

4種dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)

[編輯本段]〔PCR步驟〕

標準的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如圖所示：

現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應速度。

[編輯本段]〔PCR檢測〕

PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡(jiǎn)捷易行，成為了主流檢測方法。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

[編輯本段]〔PCR反應特點(diǎn)〕

特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關(guān)鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細胞中檢出一個(gè)靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細菌。

簡(jiǎn)便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時(shí)完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易**。

對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

〔PCR的循環(huán)參數〕

1、預變性（Initial denaturation）．

模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95℃加熱3-5分鐘。

2、引物退火（Primer annealing）

退火溫度一般需要憑實(shí)驗（經(jīng)驗）決定。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

3、引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。

延伸時(shí)間隨擴增片段長(cháng)短而定。

4、循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：

變性時(shí)間過(guò)長(cháng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。

5、循環(huán)數

大多數PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴增。

6、最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

（四）PCR中的污染和假**

PCR中污染主要來(lái)自

1、樣品間交叉污染；

2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carry-over）

[編輯本段][PCR儀器]

pcr儀器的發(fā)展

pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴增儀各參數必須準確。自perkin –elmer cetus公司第一臺pcr擴增儀問(wèn)世以來(lái)，現已有幾十家不同的廠(chǎng)家在國內外生產(chǎn)和銷(xiāo)售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經(jīng)過(guò)幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實(shí)用、高智能化和自動(dòng)化的方向發(fā)展。

為了便于了解和選購適宜的pcr實(shí)驗設備，現將部分國內外pcr擴增儀列表如下（表22-5）；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國產(chǎn)1109型dna擴增儀則是用恒溫浴機械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動(dòng)化程序高，可以兼做套式pcr，方便實(shí)用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動(dòng)控制溫度、時(shí)間及循環(huán)數，可以達到節 省勞動(dòng)力的目的。在采用這些儀器作pcr試驗之前，一般均應實(shí)測管內溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時(shí)管內因熱傳導造成的溫度滯后情況和實(shí)際到達的最高、最低溫度，用于修正設計的循環(huán)參數。溫度滯后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對變溫鋁塊式儀器影響更大些。對于配用制冷機式半導體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來(lái)保冷pcr反應后小管時(shí)，應注意冷凝水的問(wèn)題，勿使流入儀器內浸濕半導體元件而損壞儀器。

國內外生產(chǎn)的幾種dna擴增儀

1109型

北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合

機械臂

變溫水浴

電子調溫

40×0.5ml

16400元/臺

90a/b型

中科院遺傳所

機械臂

變溫水浴

電熱

14000元/臺

ptc-51a/b型

軍事醫學(xué)科學(xué)院

變溫氣流

電子調兼作套式

30×0.5ml

12000元/臺

dna thermal cycler

perkin –elmercetus(美)

變溫鋁塊

壓縮機致冷

48×0.5ml

us $ 20000.-

thermocycler

＃60

＃00

＃180

b..braun

biotech

(德)

變溫水浴98℃四檔

電熱,自來(lái)水冷卻

60×1.5ml

100×1.5ml

180×1.5ml

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ericomp inc.(美)

變溫鋁塊25～100℃

電熱,自來(lái)水冷卻

29×1.5ml

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us $4985.-

us $7980.-

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grant instrumant ltd(美)

變溫水浴0～99℃

電熱,自來(lái)水冷卻或加冷循環(huán)器

50×1.5ml

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50×1.5ml

us $250. –plus

us $ 15.-for

rack(x2)

techne phc-1

phc-2

techne ltd.(英)

變溫鋁塊0～99℃三檔

電熱500w水冷100w

54×0.5ml

54×0.5ml

24×1.5ml

￡3383. –

￡3997. -

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biothrm corp(美)

變溫氣流

-150℃

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200’s of 4×96plate

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biomertra(德) 半導體變溫

220v

3×20管

分別控溫

dm12900. -

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eppendorf(美) 變溫鋁塊

220v/100v

3×29管

us $ 3500. -

〔PCR常見(jiàn)問(wèn)題〕

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間

一般為48h以?xún)?，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多 大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。

假**

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假**。需重新設計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假**。這種假**可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣**內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)**頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假**的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。

克隆PCR產(chǎn)物

1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

最佳**入片段：載體比需實(shí)驗確定。1：1（**入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，**入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì )自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時(shí)能滿(mǎn)足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜。

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會(huì )產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的**入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗？

A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。

B）轉化完整質(zhì)粒，計算菌落生長(cháng)數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉化率為： 產(chǎn)生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：

1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞

如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標準好無(wú)核酸酶污染，不應用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。

4)對照實(shí)驗結果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗出了什么問(wèn)題？

A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿(mǎn)足大多數克隆，為提高效率，需4℃過(guò)夜。

B）**入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將**入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，**入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，**入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）**入片段不適于連接。用凝膠純化的**入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì )產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。

E）高度重復序列可能會(huì )不穩定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現**入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul

4種dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長(cháng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(huì )形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個(gè)堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會(huì )使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì )引起錯配。濃度過(guò)低又會(huì )降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著(zhù)的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過(guò)低會(huì )降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數。

溫度與時(shí)間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標準反應中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長(cháng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(cháng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì )導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會(huì )遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(cháng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(cháng)度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時(shí)間，可根據待擴增片段的長(cháng)度而定，一般1Kb以?xún)鹊腄NA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時(shí)間要稍長(cháng)些。